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學習重點 用固定相與移動相的相對極性判斷正相或逆相，再推出分析物的滯留順序。 認得矽膠表面的矽醇基（正相），以及 C4、C8、C18（ODS）等逆相固定相；分清各類層析的常用溶劑。 掌握分配係數、動相組成、pH 與溫度對滯留時間的影響，凡寫「無關」「不影響」多為錯誤敘述。 由脂肪酸的碳鏈長度與不飽和程度，判斷逆相薄層層析中滯留強弱與 Rf 大小。 區別逆相、離子交換、分子排斥與 HILIC 等分離機制及其滯留規則。 核心觀念 一、正相與逆相：先看兩相極性，再看分析物親和力 層析分離取決於分析物在固定相與移動相之間的分布與交互作用。分析物越偏好固定相，滯留越強，管柱中的滯留時間越長。若分配係數定義為固定相濃度除以移動相濃度，分配係數越大，越偏向固定相，滯留時間越長。依固定相極性的高低，液相層析可分為正相與逆相。 比較項目正相層析逆相層析 固定相極性較高，如矽膠（silica gel）、氧化鋁極性較低，如 C18（ODS）、C8、C4 鍵結相或液態石蠟 移動相極性較低，如正己烷搭配二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等極性較高，如水或緩衝液搭配甲醇、乙腈 滯留較強者極性較大者疏水性較強、極性較小者 先沖提者極性較小者極性較大者 逆相的定義是移動相極性高於固定相極性，與管柱內流向（由上而下或由下而上）無關。逆相適用範圍很廣，可分析非極性到中極性化合物，是 HPLC 最常用的模式。 二、常見固定相與溶劑搭配 矽膠表面的矽醇基（silanol，Si–OH）具極性，可與分析物形成氫鍵，是正相固定相的官能基。Siloxane（Si–O–Si）是矽膠骨架結構；n-Octyl（C8）、n-Octadecyl（C18）則是逆相鍵結相的烷基。 C4、C8、C18 分別為丁基、辛基、十八烷基鍵結矽膠，都用於逆相層析；C18 又稱 ODS。在 ODS 上極性較大者先沖提，這叫逆相分離，不是正相。 正相常用溶劑有正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，甲醇可作為較強的極性修飾劑。因此正己烷－二氯甲烷混合溶媒應對應矽膠（silica gel）管柱；離子交換與 ODS 管柱都使用水性動相。 逆相常用溶劑為水（緩衝液）、甲醇、乙腈，有時用四氫呋喃。氯仿與水不互溶，不是逆相常用溶劑；把氯仿與甲醇、乙腈並列為逆相溶劑是錯誤寫法。甲醇則可用於正相與逆相，不能只看溶劑名稱判斷分離模式。 三、由結構判斷滯留順序 正相（矽膠）：官能基極性越大、越能形成氫鍵，滯留越久。 正己醇（含 –OH）＞苯（π 電子可與矽醇基作用）＞正己烷（完全非極性），滯留時間依此遞減。 苯甲酸（–COOH，強氫鍵）滯留強於苯甲醇與苯甲醛；所以苯甲醇比苯甲酸滯留時間短，苯甲醛也比苯甲酸更不易滯留。 逆相：非極性碳鏈越長，疏水性越強，滯留越久。苯接上戊基成為戊基苯（amylbenzene）後疏水性增加，因此戊基苯比苯滯留時間長。 四、滯留時間會隨操作條件改變 滯留時間受固定相、動相組成、流速、溫度及分析物解離狀態影響。 動相組成：逆相中提高甲醇或乙腈比例，沖提力增加，滯留時間縮短；正相中提高極性溶劑比例，同樣使沖提加快。 溫度：溫度改變分配平衡與黏度，一般升溫使滯留時間縮短。 pH：酸、鹼性分析物的解離程度隨 pH 改變。鹼性物質在低 pH 下質子化成離子型，較親水，逆相滯留通常變短；pH 升高則分子型增加，滯留變長。因此「鹼性分析物的滯留時間與緩衝液 pH 無關」是錯誤敘述。 五、逆相薄層層析分離脂肪酸 以 Kieselguhr G（矽藻土）承載 liquid paraffin（液態石蠟）為固定相、乙酸為展開液時，真正的固定相是非極性的液態石蠟，展開液極性較高，屬於逆相分配層析。矽藻土只是載體，不可套用矽膠正相規則。 Rf＝斑點自原點移動距離／溶劑前緣自原點移動距離。滯留越強，斑點移動越短，Rf 越小；管柱中滯留越強則滯留時間越長，兩者方向相反。 碳數相同：雙鍵越少（越飽和），極性越低、越疏水，滯留越強，Rf 越小。 飽和度相同：碳鏈越長，越疏水，滯留越強，Rf 越小。 脂肪酸分子式碳數：雙鍵數逆相 Rf 趨勢 硬脂酸C18H36O2C18：0最小（碳鏈最長且飽和） 油酸C18H34O2C18：1較大 亞麻酸C18H30O2C18：3更大 棕櫚酸C16H32O2C16：0大於硬脂酸（碳鏈較短） 同為 C18 時 Rf 為硬脂酸＜油酸＜亞麻酸；棕櫚酸雖飽和，但碳鏈比硬脂酸短，Rf 較大。故四者中硬脂酸 Rf 最小。判讀分子式時，碳數相同而氫數越少，代表雙鍵越多、極性越高、Rf 越大。一般而言，多一個雙鍵對滯留的影響約略相當於少兩個碳，所以油酸（C18：1）與棕櫚酸（C16：0）的位置相近，不易分離；遇到碳數與雙鍵數同時不同的成分，不宜只用單一規則硬排。 六、其他分離機制 分子排斥層析（粒徑篩析、凝膠滲透）：依分子大小分離。大分子無法進入孔洞，先沖提；小分子進入孔洞，路徑較長，較晚沖提。因此苯丙胺酸（小分子）的滯留時間比膠原蛋白長；凝膠滲透管柱可用來分離較大分子。 離子交換層析：陽離子交換樹脂帶負電，保留陽離子，所以陰離子先流出、陽離子較晚流出；陰離子交換樹脂則保留陰離子。離子交換填充劑的基材常為聚苯乙烯－二乙烯苯樹脂或矽膠；氧化鋁主要作為吸附劑，不是離子交換填充劑的常用基材。 強陰離子交換樹脂與逆相：常見的聚苯乙烯－二乙烯苯樹脂骨架本身具疏水性，在含水－有機溶劑的動相中也能產生逆相式滯留，所以「強陰離子交換樹脂可用於逆相層析」視為正確敘述。 HILIC（親水作用層析）：使用極性固定相，搭配高比例有機溶劑加少量水的動相，極性物質滯留較強，分離行為較接近正相層析。 C8 與 C18 比較高極性樣品：對疏水性樣品，C18 的疏水滯留較強，C8 滯留較短。但高極性樣品主要不是靠疏水作用滯留，在兩種管柱上都滯留很弱；且 C8 碳鏈較短，殘餘矽醇基較容易接觸分析物，極性作用可能較明顯。因此「高極性樣品在 C8 管柱的滯留時間比 C18 短」被判為錯誤敘述。「C8 較 C18 滯留短」的規則只適用於靠疏水作用滯留的樣品。 常考陷阱 以流向定義正逆相：正逆相看兩相相對極性；逆相是移動相極性高於固定相。 ODS 上極性大者先出叫正相：錯，ODS 為逆相。 矽膠上極性大者先出：錯，正相是極性小者先出，極性大者滯留較久。 逆相動相是低極性有機溶劑：錯，逆相動相是水性高極性混合溶劑。 氯仿列為逆相常用溶劑：錯，氯仿與水不互溶，屬正相溶劑；甲醇則正逆相都可用。 正相固定相官能基選 siloxane 或烷基：正確是 silanol（Si–OH）。 pH、溫度、動相組成「不影響」滯留時間：都會影響，尤其是酸鹼性分析物的解離。 逆相只能分析非極性物質：錯，中極性化合物也常用逆相分析。 分子排斥層析小分子先出：錯，大分子先出，小分子滯留較長。 陽離子交換樹脂上陽離子先出：錯，陽離子被保留，陰離子先出。 氧化鋁是離子交換基材：錯，氧化鋁屬吸附劑。 逆相中苯比戊基苯滯留久：錯，碳鏈越長滯留越久。 Rf 與滯留時間同向比較：滯留強時滯留時間長，但 Rf 小。 看到矽藻土就套用正相規則：液態石蠟才是固定相，屬於逆相。 雙鍵多的脂肪酸 Rf 最小：錯，逆相中飽和、長鏈者 Rf 最小，雙鍵越多 Rf 越大。 記憶口訣 正相：矽醇極性留，小極先溜走；逆相：碳鏈疏水留，大極先出口。 石蠟逆相跑脂酸：鏈長、雙鍵少，留得牢，Rf 小。 分子排斥大先走，離子交換異性留。