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學習重點 分清楚固定相基質、表面官能基與表面修飾：矽膠或有機聚合物是基質；C18、苯基、氰丙基、胺丙基、四級銨基等官能基決定主要的分離選擇性。 掌握矽膠表面殘餘矽醇基的影響，以及封端、矽烷鍵結、雙齒鍵結與極性嵌入基團的作用；認識以含碳率表示鍵結與覆蓋程度。 比較矽膠與聚合物基質：聚合物的主要優勢是可用的 pH 範圍較廣；它對有機溶媒或高親脂性移動相並不比矽膠穩定。 辨認常見固定相的極性與用途，並理解胺基（NH2）管柱切換正相與逆相時，須以可與兩端互溶的過渡溶劑（如乙醇）銜接。 核心觀念 一、先分辨基質與鍵結官能基 矽膠是最常見的 HPLC 固定相基質，表面具有矽醇基（Si–OH，silanol group），因此未修飾矽膠屬於極性固定相，適合正相分離，例如不同脂類的分離可使用矽膠。將表面修飾為烷基、苯基、氰丙基或胺丙基後，會改變固定相的疏水性、極性與離子交換能力。 比較同類烷基鍵結相時，碳氫鏈愈長，疏水性愈強、極性愈低；碳鏈愈短，極性相對愈高（例如 C4、C8 比 C18 極性高）。 固定相性質與常見用途 未修飾矽膠極性固定相，常用於正相層析，可分離不同脂類。 C18／ODS十八烷基鍵結矽膠，疏水性強，是最常用的逆相固定相，可分析中性、酸性及鹼性化合物。 苯基矽烷矽膠具芳香環選擇性，可利用疏水作用與 π–π 作用，分析含芳香環及多數目芳香環的化合物。 氰丙基矽膠中度極性；依移動相條件可用於正相或逆相。 胺丙基矽膠極性鍵結相，可用於糖類、界面活性劑等分析；胺基質子化時呈弱陰離子交換性質；可用於正相與逆相。不是蛋白質分析的常用固定相。 四級銨基固定相帶固定正電荷，是強陰離子交換樹脂的典型作用基團。 C18 可以分析鹼性化合物。鹼性分析物可能與殘餘矽醇基產生次級作用而拖尾，但可藉由封端管柱、調整移動相 pH 與緩衝條件、加入競爭性胺類等方式改善，並非「無法分析」。蛋白質分析則常用大孔徑短鏈（C4、C8）逆相、離子交換或粒徑排除層析，而非胺丙基矽膠。 二、殘餘矽醇基、封端與含碳率 體積較大的烷基鍵結試劑受立體障礙影響，無法與矽膠表面所有矽醇基反應，因此 ODS 表面會留下殘餘矽醇基（residual silanol group）。它們可與分析物產生氫鍵或離子性作用；尤其矽醇基解離帶負電、鹼性分析物帶正電時，容易產生額外吸附，是層析峰拖尾的因素之一。 封端（endcapping）是再以體積小的矽烷化試劑（如三甲基氯矽烷、六甲基二矽氮烷）與殘餘矽醇基反應，以三甲基矽基遮蔽它們。封端可改善峰形，並增加充填物對高 pH 溶液的穩定性；同理，將矽石表面的羥基置換成烷基，可增加其穩定性。但封端只是提升耐受度，矽膠在強鹼下仍有溶解極限，實際仍須遵守管柱規格。 含碳率（carbon rate／carbon load）是充填物中碳的質量百分比，用來表示有機基團的鍵結量，Endcapped ODS 上殘餘矽醇基的覆蓋程度即以含碳率表示。一般而言，含碳率愈高，表面被有機基團覆蓋得愈完整，疏水性與滯留力也愈強。 三、表面修飾如何提升固定相性能 矽烷鍵結：以矽烷化試劑將有機官能基藉共價鍵（Si–O–Si–C）固定於矽膠表面，可提升固定相的安定性。 雙齒配位基（bidentate ligands）修飾：以兩個連接點與表面鍵結，鍵結較牢固、不易水解脫落，可增加固定相對 pH 值的耐受性。 極性嵌入基團：在疏水鍵結鏈中嵌入醯胺鍵等極性基團，可增加水分子進入固定相的能力（高水相下不易塌陷），並提供額外的極性作用，有助於極性分子的滯留，也能遮蔽殘餘矽醇基。 四甲氧基矽烷（tetramethoxysilane，TMOS）不能用來覆蓋矽醇基。它帶有四個可水解的甲氧基，水解縮合後反而會生成新的 Si–OH 與矽氧網絡，是溶膠–凝膠法製備矽膠（例如整體式管柱）的原料，而非封端試劑。不要把「四甲氧基矽烷」與封端用的「三甲基矽烷化試劑」混淆。 四、矽膠與有機聚合物基質的比較 比較項目矽膠基質有機聚合物基質（如 PS-DVB） pH 耐受性一般約 pH 2～8；高 pH 下矽膠溶解，低 pH 下鍵結相易水解。可用 pH 範圍較廣（可達 pH 1～13 左右），是主要優點。 有機溶媒／高親脂性移動相機械強度高、不膨潤，對有機溶媒較穩定。可能隨溶媒改變而膨潤或收縮，對有機溶媒與高親脂性移動相較不穩定。 機械強度與效率耐高壓、管柱效率高。耐壓性與管柱效率通常較差。 價格與應用價格較低，應用最廣泛。通常較貴，應用範圍不如矽膠普遍。 鍵結相（bonded phase）以共價鍵將有機固定相連接於矽膠；包覆相（coated phase）只以物理方式將液態固定相塗覆於載體。鍵結相不易被移動相洗脫流失，使用壽命較包覆相長。 五、胺基管柱的正相與逆相切換 NH2 管柱可用於正相（搭配己烷等非極性移動相）及逆相（搭配含水移動相，例如糖類分析常用乙腈–水）分離。 切換時，正相常用的非極性溶劑與水不互溶，若直接換成水會造成分相、置換不完全並使管柱床層不均。因此須先以同時能與非極性有機溶劑及水互溶的醇類過渡溶劑沖洗銜接，乙醇（或異丙醇）是最適用的選擇。 水：與正相溶劑不互溶，不能直接用於切換。 乙酸乙酯：與水互溶性有限，無法作為橋接溶劑。 二甲基甲醯胺：黏度高、沸點高、UV 吸收強且不易沖淨，不是常用的沖洗過渡溶劑。 常考陷阱 「碳氫鏈愈短，愈具低極性」：方向顛倒；鏈愈短極性愈高，鏈愈長疏水性愈強。 「C18 無法用於鹼性化合物之分析」：錯。鹼性物質只是容易拖尾，可經封端或條件調整改善。 「透過 tetramethoxysilane 可覆蓋矽醇基」：錯。封端用的是三甲基矽烷化試劑；TMOS 是製備矽膠網絡的原料。 「封端可增加對高 pH 的穩定性」「羥基置換成烷基可增加穩定性」「矽烷鍵結可提升安定性」「雙齒配位基可增加 pH 耐受性」「嵌入醯胺鍵有助極性分子滯留」：這些都是正確敘述，不要誤選。 「Endcapped ODS 的覆蓋程度以含碳率表示」：正確敘述。 「聚合物對有機溶媒／高親脂性移動相較穩定」「聚合物較便宜」「聚合物較廣泛用於有機化合物分離」：皆錯；聚合物唯一的典型優點是可用 pH 範圍較廣。 「胺丙烷基矽膠常用於蛋白質分析」：錯；它常用於糖類與界面活性劑分析。 「苯基矽烷可分析多芳香環化合物」「氰丙基為中度極性」「脂類分離適用矽膠」「四級銨鹽為強陰離子交換基團」：皆為正確敘述。 「鍵結相壽命比包覆相短」：錯；共價鍵結不易流失，壽命較長。 NH2 管柱正逆相切換選水、乙酸乙酯或 DMF：皆不適當，應選與兩端互溶的乙醇。 記憶口訣 「長鏈疏水短鏈極、苯抓芳環氰中極；胺丙糖類界面劑、四級銨換陰離子。」對應官能基的極性與用途。 「矽醇拖尾靠封端，三甲封端非四甲氧；含碳率表覆蓋度，鍵結雙齒更耐久。」表面修飾的種類與作用。 「聚合只贏 pH 廣，溶媒價格都輸矽；NH2 換相先走醇，乙醇搭橋水油通。」基質比較與模式切換。