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學習重點 逆相層析是「固定相極性低、移動相極性高」。親脂性越強的分析物通常滯留越久，極性越大則越早沖提。 要能對應名稱：C18＝ODS＝octadecyl（n-octadecyl）silane-bonded silica；C8＝octyl silane-bonded silica。另須比較 CN、NH2、diol、phenyl 等鍵結基的作用力。 要能判斷有機溶劑比例、移動相極性、溫度與加酸對滯留因子 k′ 的影響，以及逆相梯度的方向。 要能由碳鏈長度、羥基、醚化、酯化與胺基取代等結構差異，推估沖提順序。 要能區分固定相評估參數 kPB、αCH2、αT/O、αC/P 的意義，不可當成「越大，極性物越滯留」的通則。 核心觀念 一、逆相層析的基本配置與滯留原理 逆相 HPLC 的固定相極性低於移動相。固定相通常是表面鍵結烷基的矽膠，移動相則為水或緩衝液，搭配甲醇、乙腈等有機溶劑。分析物在兩相之間分配；在其他條件相近時，越親脂、越疏水的化合物越容易留在疏水固定相上，滯留時間越長。極性較大的化合物滯留時間較短，會先被沖提出來。 滯留因子又稱容量因子，常寫作 k 或 k′＝（tR－t0）／t0。tR 為分析物滯留時間，t0 為未滯留物通過管柱的時間。同一條件下，k′ 越大表示滯留越強。 二、固定相名稱、碳鏈與官能基 固定相名稱與結構重點主要判斷方向 C18／ODS十八烷基矽烷鍵結矽膠：octadecyl silane-bonded silica particles；修飾基團為 n-octadecyl最常用的逆相固定相，疏水作用最強，可分析小分子、胜肽與蛋白質等。 C8辛基矽烷鍵結矽膠：octyl silane-bonded silica particles碳鏈比 C18 短，疏水性較弱。相同條件下，低極性分析物的滯留通常較短。 Cyano／CN氰丙基鍵結矽膠（cyanopropyl silica）中度極性，可提供偶極－偶極作用。 Amino／NH2胺丙基鍵結矽膠（aminopropyl silica）中度極性，可用於界面活性劑等分析。 Diol二醇基鍵結矽膠極性較高，可形成氫鍵；對低極性物的疏水滯留弱。 Phenyl苯基鍵結矽膠提供芳香環 π–π 相關選擇性，與 C8、C18 不同。 Silica未修飾的裸矽膠表面為極性矽醇基，屬正相固定相，不是逆相填充劑。 以相同移動相分析低極性檢品時，滯留強弱大致為 C18＞C8＞cyano、diol，因此 C18 滯留最長。碳鏈越短，疏水作用越弱，滯留應較短；「C8 碳鏈較短，所以滯留時間一定比較長」是錯誤敘述。 要區分矽膠基材與裸矽膠。逆相填充劑以矽膠為基材，但表面已鍵結疏水基。「矽膠為常用之充填劑」描述的是正相層析，不是逆相。巨孔樹脂也不是逆相 HPLC 靜相的標準描述。 三、移動相與溫度如何改變滯留 有機溶劑比例↑（移動相極性↓）：沖提力增強，k′ 降低，滯留時間縮短。 水比例↑（移動相極性↑）：疏水分析物更傾向留在固定相，滯留時間變長。所以「動相極性增加，檢品滯留時間縮短」是錯的。 梯度沖提：由高水比例開始，逐步提高有機溶劑比例。也就是移動相極性由高到低，不是由低到高。 溫度↑：分析物在固定相的分配減少，移動相黏度也下降，k′ 通常降低。 加入少量酸（如 0.1% 乙酸）：只影響可離子化的分析物。甲苯、丙基苯、戊基苯等中性烷基苯的 k′ 幾乎不變。 四、由結構判斷沖提順序 同系物看碳鏈：烷基側鏈越長越疏水。在 C18 與甲醇／水系統中，滯留時間由長至短為戊基苯（amylbenzene）＞丙基苯（propylbenzene）＞甲苯（toluene）。順序寫反就是錯誤選項。 嗎啡類看取代基：在 ODS、pH 8.0 條件下： 3-O-benzylmorphine：3 位酚羥基換成苄基醚，大幅增加疏水性，滯留最長。 Ethylmorphine（3-O-乙基）與 codeine（3-O-甲基）：酚羥基被醚化，比 morphine 更親脂；乙基又比甲基更疏水。 Morphine：帶有游離酚羥基，極性較高。 Normorphine：在 morphine 的基礎上再去掉 N-甲基，成為二級胺，多了可形成氫鍵的 N–H，極性最大，滯留最短。 大致順序（長→短）：3-O-benzylmorphine＞ethylmorphine＞codeine＞morphine＞normorphine。 類固醇看羥基與酯化：游離羥基會增加極性；羥基被酯化後，疏水性增加，滯留變長。Betamethasone 本身沒有酯化，極性最高，最早沖出。valerate（戊酸酯）與 dipropionate（雙丙酸酯）等酯類則滯留較久。17-valerate 與 21-valerate 分子式相同，但酯化位置不同，滯留也不同。以 C18、甲醇／水（75：25）沖提該組五個皮質類固醇時，滯留時間排第 3 位的是 betamethasone 17-valerate。 蛋白質看親脂性：在一般逆相梯度條件下，親脂性越強，需要越高的有機溶劑比例才會被沖出，滯留越久。題目已給親脂性排序時，最親脂者滯留最長，不要改用分子量判斷。 五、固定相特性參數（Tanaka 評估法） 參數意義 kPB戊基苯的滯留因子，反映固定相的疏水滯留能力（與碳含量、表面積有關） αCH2疏水選擇性：辨別相差一個 CH2 的同系物的能力 αT/O形狀（立體）選擇性：辨別平面與非平面分子的能力 αC/P氫鍵能力：反映固定相（殘餘矽醇基）與分析物的氫鍵作用 這些參數是比較不同管柱特性用的指標，各自使用特定探針測定。不能推論成「某參數越大，所有極性檢品的滯留時間就越長」。極性分析物的滯留還受離子化、殘餘矽醇基與移動相組成影響，這類敘述不宜當成通則背誦。 常考陷阱 octyl 與 octadecyl 看反：octyl＝C8，octadecyl＝C18＝ODS。phenyl 與 silica 都不是 C8 或 C18。 「碳鏈較短，滯留一定較長」：方向相反。碳鏈短，疏水作用弱，滯留較短。 「動相極性增加，滯留縮短」：逆相中水越多（極性越高），疏水物滯留越長。 「固定相為高極性」、「動相為非極性」、「矽膠為常用充填劑」：這些都是正相層析的描述。 「梯度由低極性到高極性」：逆相梯度是有機溶劑逐漸增加，極性由高到低。 同系物順序寫反：碳鏈越長滯留越久，所以 amylbenzene 最晚，toluene 最早。 加酸一定改變滯留：中性烷基苯幾乎不受影響，先看分析物能否離子化。 只看分子大小：normorphine 少一個甲基且多一個 N–H，極性最大，最早沖出。羥基被醚化或酯化則會延長滯留。 把 kPB、αCH2 等參數當成極性物的滯留強度：它們是管柱特性指標，不是通則。 記憶口訣 「逆相靜不極、水多留更久；有機一加就快走。」 「十八 ODS 最常用，辛基 octyl 只有八。」 「長鏈、苄基、酯化留得久；去甲、游離羥基跑第一。」