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學習重點 辨識蛋白質中的芳香族胺基酸：苯丙胺酸（Phe）、酪胺酸（Tyr）、色胺酸（Trp）具有芳香環，是近紫外光區的主要發色基團。 掌握蛋白質280 nm 附近的吸收主要來自酪胺酸與色胺酸，並了解以此定量蛋白質的原理與限制。 區分紫外吸收與內生螢光：具有發色基團，不代表一定有強螢光。 理解酪胺酸、色胺酸的內生螢光會反映周圍環境，可用於胜肽或蛋白質的構形與穩定性分析。 核心觀念 一、發色基團：先找能吸收光的結構 發色基團（chromophore）是分子中能吸收特定波長光線的結構。就本單元的近紫外光分析而言，辨識重點是胺基酸側鏈是否具有芳香環（共軛 π 電子系統）；其電子可吸收紫外光而發生 π→π* 躍遷。 酪胺酸（Tyrosine）的側鏈具有酚環，因此是本單元所指的發色基團代表。相較之下，精胺酸（Arginine）的側鏈含胍基，白胺酸（Leucine）、丙胺酸（Alanine）為脂肪族側鏈；脯胺酸（Proline）雖有環狀結構，但其吡咯啶環不是芳香環，不能因為「有環」就判定具有芳香族胺基酸的近紫外光特性。 判讀時應限定波長範圍。不能把「在 280 nm 附近沒有明顯吸收」擴大成「在所有紫外波長都不吸收」；蛋白質的其他結構，例如肽鍵，可在更短波長（遠紫外光區，約 190～220 nm）產生吸收。 二、芳香族胺基酸的光譜特性 胺基酸側鏈特徵最大吸收（約）紫外吸收與內生螢光重點 苯丙胺酸（Phenylalanine，Phe）苯環約 257 nm吸收係數小，對蛋白質 280 nm 吸收的貢獻很小；螢光很弱，分析上少用。 酪胺酸（Tyrosine，Tyr）酚環約 274～275 nm是 280 nm 附近吸收的重要來源；具有內生螢光（發射約 303 nm），可作為胜肽螢光分析的訊號來源。 色胺酸（Tryptophan，Trp）吲哚環約 280 nm吸收係數最大，是 280 nm 吸收的最大貢獻者；蛋白質內生螢光通常以其最顯著，發射波長對局部環境敏感。 「芳香族」與「280 nm 主要吸收來源」是不同層次的判斷。三者都有芳香環，但蛋白質在 280 nm 附近的吸收，主要歸因於酪胺酸與色胺酸；此外，雙硫鍵（cystine）在此波段僅有很小的貢獻。 精胺酸、離胺酸（帶正電）、天門冬胺酸、麩胺酸（帶負電）、甘胺酸（無側鏈）都不是 280 nm 吸收的來源。組胺酸雖具有芳香性的咪唑環，但吸收落在更短波長，也不是 280 nm 吸收或內生螢光分析的主要來源，不能直接套用酪胺酸、色胺酸的特性。 三、280 nm 吸收如何用於蛋白質定量 紫外吸收法是測量樣品吸收多少入射光。固定波長、光徑及樣品條件時，可依比耳－朗伯定律：A＝εbc，由吸光度估算濃度；其中 A 為吸光度、ε 為莫耳吸光係數、b 為光徑、c 為莫耳濃度。 蛋白質所含酪胺酸、色胺酸的數量不同，吸光係數也不同。因此，相同濃度的不同蛋白質，不一定具有相同的 280 nm 吸光度。定量時應使用該蛋白質適用的吸光係數（可由其 Trp、Tyr 數目估算）或以標準品校正。 此法利用蛋白質本身的吸收，不需外加試劑、不破壞樣品，操作快速；但須注意： 核酸在 260 nm 附近強吸收，污染時會干擾 280 nm 測定（常以 A260/A280 比值評估純度）。 樣品混濁、聚集造成的光散射會使吸光度假性升高。 缺少酪胺酸、色胺酸的胜肽，在 280 nm 的偵測靈敏度很差，需改用其他波長或方法。 四、內生螢光與胜肽、蛋白質穩定性 內生螢光是分子本身吸收激發光後所發出的螢光，不需外加螢光標記。蛋白質中可利用的內生螢光來源為色胺酸與酪胺酸；苯丙胺酸雖也有螢光，但量子產率很低，通常可忽略。 因此，胜肽藥物的結構若含酪胺酸，即具備可供螢光光度法利用的內生螢光來源。不能因為蛋白質螢光常由色胺酸主導，就誤認酪胺酸沒有螢光；在不含色胺酸的胜肽中，酪胺酸正是主要的螢光來源。實務上以約 280 nm 激發時酪胺酸與色胺酸都會被激發，若改用約 295 nm 激發，則主要只激發色胺酸。 螢光不只與殘基數量有關，也受周圍極性、溶劑暴露程度及淬熄作用影響。蛋白質或胜肽發生展開、聚集或局部構形改變時，常造成螢光強度或發射光譜改變，因此可用來追蹤構形變化與穩定性，且靈敏度通常高於紫外吸收法。 以色胺酸為例，從疏水的內部暴露到較極性的水相時，發射峰常往較長波長移動（紅移）；但螢光強度可能上升或下降，須依實際環境判讀。螢光變化是穩定性分析的線索，不能單憑強度下降就斷言藥物已發生化學分解。 五、紫外吸收與內生螢光比較 比較項目紫外吸收（約 280 nm）內生螢光 測量對象被吸收的入射光量激發後發射的光 主要來源色胺酸、酪胺酸（雙硫鍵少量）色胺酸、酪胺酸（苯丙胺酸極弱） 主要用途蛋白質定量（A＝εbc）構形變化、展開、穩定性追蹤；微量測定 靈敏度較低較高 環境敏感度較低高，發射波長與強度隨環境改變 常考陷阱 「有環狀結構就有發色基團」：錯。脯胺酸的環不是芳香環；應辨認是否為芳香環（如 Tyr 的酚環、Trp 的吲哚環），而非只看有沒有環。 「蛋白質 280 nm 吸收主要來自帶電胺基酸」：錯。酸性（Asp、Glu）、鹼性（Arg、Lys）或是否帶電都不是判斷關鍵，應找酪胺酸與色胺酸。 「組胺酸有芳香環，所以是 280 nm 主要吸收來源」：錯。咪唑環吸收在較短波長，280 nm 仍以 Tyr、Trp 為主。 「所有芳香族胺基酸對 280 nm 吸收都同樣重要」：錯。苯丙胺酸最大吸收約 257 nm 且吸收弱，不是此波段的主要貢獻者。 「只有色胺酸能產生內生螢光」：錯。酪胺酸也能發出螢光，含酪胺酸的胜肽可用螢光光度法分析其穩定性。 「有紫外吸收就一定有強螢光」：錯。吸收與螢光是不同過程，吸收光能後不一定有效率地以螢光釋放（如苯丙胺酸）。 「螢光越強，蛋白質就一定越穩定」：錯。訊號受濃度、局部環境與淬熄等因素影響，須在可比較的條件下解讀。 記憶口訣 「二八零，看酪色；內生光，酪色有；看見環，先辨芳。」280 nm 附近吸收記酪胺酸（Tyr）、色胺酸（Trp）；兩者都有內生螢光，可測胜肽穩定性；看到環狀結構，先確認是不是芳香環。