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學習重點 分清分析格式：均質性分析不需分離游離與結合標記物；異質性分析需要分離。競爭型與非競爭型則依結合機制區分，兩組分類不可混為一談。 掌握訊號來源：酵素可產生顯色、螢光或化學發光訊號；一般化學發光不需外來激發光，但LOCI需要光激發感光微粒。 熟悉FPIA與微珠分析：競爭性FPIA的偏極化程度與待測藥物濃度呈反向關係；不同螢光編碼微珠可進行多重分析。 辨識放射性標記：典型RIA標記抗原，IRMA標記抗體；蛋白質直接碘化的重要位置是酪胺酸側鏈的芳香環。 記住半衰期排序：氚＞鈷-58＞碘-125＞磷-32，氚以年計，其餘三者以天計。 核心觀念 一、分析格式與訊號判讀 免疫分析利用抗原與抗體的專一性結合，再以標記物產生可量測訊號。均質性或異質性著重是否需要分離游離與結合標記物；競爭型或非競爭型則著重待測物如何參與反應。 均質性分析：直接在反應液中判讀，不需先分離游離與結合標記物，代表方法包括FPIA與典型LOCI。 異質性分析：藉分離、清洗等步驟，去除未結合標記物後讀取訊號。 競爭型分析：待測物與標記物競爭有限的抗體結合位置；若量測結合部分，訊號通常隨待測物增加而降低。 非競爭型分析：典型雙抗體夾心法中，待測物愈多，結合的標記抗體愈多，在有效測量範圍內訊號通常愈高。 二、LOCI的微粒與發光原理 LOCI為發光氧通道免疫分析，使用感光微粒（sensitizer particle）與化學發光微粒（chemiluminescent particle）。典型設計由待測抗原促使兩類微粒透過免疫結合而彼此接近。 感光微粒受到外來光源激發後，產生單態氧；單態氧擴散距離有限，只有鄰近的化學發光微粒能有效接受作用並產生發光訊號。因此，微粒是否接近可轉換成待測物的定量訊號。 本單元採用的典型LOCI屬於均質性、非競爭型分析，不需先分離游離與結合微粒。不能因為使用微粒，就認定它是異質性分析；也不能因名稱含有冷光，就認定整個流程不需激發光源。 三、螢光標誌微珠與多重分析 將不同專一性的抗體分別接在不同螢光編碼的微珠上，儀器便可依微珠的識別訊號，區分各類待測物，再測量其反應訊號。其主要特點是多重分析（multiplexing），可在同一份樣本中同時偵測兩種以上待測物。 螢光編碼主要負責辨識微珠類別，不能直接推論為延長試劑保存期限、提高待測物穩定度或減少交叉反應。交叉反應仍與抗體專一性及反應條件有關。 四、鹼性磷酸酶受質與訊號種類 酵素標記本身不限定讀取方式，須看受質反應後產生何種訊號。鹼性磷酸酶（ALP）可搭配不同受質，分別進行比色、螢光或化學發光測定。 受質反應與判讀重點 Umbelliferone phosphate水解後形成具螢光的umbelliferone，屬螢光受質。 p-Nitrophenyl phosphate水解後形成p-nitrophenol，在鹼性條件下產生黃色訊號，用於吸光比色。 Adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate經去磷酸化後引發分解與化學發光，屬化學發光受質。 Creatine phosphate主要參與能量轉移，不是此處用來產生螢光的受質。 五、螢光偏極化免疫分析（FPIA） 競爭性FPIA試劑含有螢光標記的藥物或其類似物，與樣本中的未標記藥物競爭有限的抗體結合位置。它以偏極光激發螢光標記物，再測量放射螢光保留偏極方向的程度。 游離標記物：體積小、旋轉快，偏極化程度低。 與抗體結合的標記物：形成較大複合體、旋轉慢，偏極化程度高。 因此，待測藥物愈多→標記藥物與抗體結合愈少→偏極化程度愈低；反之，偏極化程度高，代表待測藥物濃度低。這是在固定分析系統內判讀濃度，不能直接解讀成待測物本身的分子量較大。 FPIA屬於均質性分析，不需先分離游離與結合標記物，也不是使用酵素標記抗體來產生訊號。 六、光學偵測是否需要光源 方法外來光源需求與測量內容 一般化學發光測定（chemiluminometry）由化學反應產生光，不需外來激發光源。 螢光測定（fluorometry）需激發光源，測量受激發後產生的螢光。 散射光測定（nephelometry）需入射光，測量免疫複合體等粒子造成的散射光。 分光光度測定（spectrophotometry）需入射光，依通過樣本後的光強度計算吸光度。 「不需光源」不代表不需光偵測器。另須區分一般化學發光測定與需先光激發的LOCI，避免將前者的特性套用到所有發光分析。 七、RIA與IRMA比較 比較項目RIAIRMA 名稱放射免疫分析免疫放射計量分析 典型格式競爭型非競爭型，常採雙抗體夾心法 放射性標記對象抗原抗體 待測抗原增加時抗體結合的標記抗原減少，結合部分計數降低結合的標記抗體增加，計數通常升高 最終偵測放射線計數放射線計數 典型RIA需要高純度抗原來製備標記抗原，使標記物能與樣本抗原競爭抗體。IRMA則將放射性標記接在抗體上。兩者都使用放射性核種，均不是以340 nm吸光度作為最終讀值。 八、碘-125的蛋白質標記位置 蛋白質直接放射性碘化的重要位置是酪胺酸（tyrosine）側鏈的酚環，碘取代芳香環上的氫。應記成「碘標在酪胺酸的芳香環」，而非把碘接在酚羥基的氧上。 辨識胺基酸時，應選酪胺酸，而非天門冬醯胺、絲胺酸或色胺酸。即使題目指定標記的是抗體，直接碘化位置仍依蛋白質側鏈的化學性質判斷。 九、常用核種的物理半衰期 物理半衰期是放射性原子數或活度因核衰變而降為原來一半所需的時間，與人體代謝、排泄所描述的生物半衰期不同。 核種物理半衰期約值 氚（³H）12.3年 鈷-58（⁵⁸Co）71天 碘-125（¹²⁵I）59～60天 磷-32（³²P）14.3天 由長至短為³H＞⁵⁸Co＞¹²⁵I＞³²P。其中氚明顯最長；半衰期愈長，活度降至原來相同比例所需的時間愈久。 常考陷阱 「LOCI是異質性分析」：典型LOCI為均質性，使用微粒不等於必須分離。 「所有冷光分析都不需激發光」：一般化學發光不需外來激發光，但LOCI需要光激發感光微粒。 「微珠能減少交叉反應」：不同螢光編碼微珠的主要特色是多重偵測，並不保證抗體專一性提高。 「ALP受質都產生相同訊號」：須區分umbelliferone的螢光、p-nitrophenol的顯色及dioxetane衍生物的化學發光。 「FPIA偏極化高代表藥物多」：競爭性FPIA恰好相反，偏極化高代表待測藥物少。 「IRMA沒有放射性，或標記在抗原」：IRMA使用放射性標記抗體；典型RIA才使用標記抗原。 「碘接在酪胺酸的羥基氧」：直接碘化主要發生在酪胺酸側鏈的芳香環上。 「質量數愈大，半衰期愈長」：半衰期無法依質量數大小直接推算，須記住核種的實際排序。 記憶口訣 RIA標抗原，IRMA標抗體；看結合訊號，競爭反、夾心正。 偏極高，結合多；競爭藥物反而少。 半衰長短：氚、鈷、碘、磷；氚算年，其餘算天。