阿摩線上測驗
登入
阿摩線上測驗
登入
學習重點 胺基酸分析須區分分離、顯色與定量：薄層層析可分離胺基酸，ninhydrin 可使胺基酸呈色；精確定量則可採用高效能液相層析、毛細管電泳或質譜分析。 薄層層析的移動速度取決於分析條件：極性固定相搭配非極性移動相時，側鏈較不具極性的胺基酸通常保留較弱、移動較快。 選擇定量方法須比較選項：特定胺基酸定量可選質譜分析；高效能液相層析與毛細管電泳也適合精確定量，不宜建立所有情境通用的優劣排名。 先天胺基酸代謝異常的採檢須配合臨床情境：血液與尿液同步收集、適當抗凝及去蛋白質均有助分析；不可自行將禁食當成一律必要的條件。 核心觀念 一、Ninhydrin：胺基酸的典型顯色試劑 Ninhydrin（茚三酮）可與胺基酸的游離胺基反應，多數一般 α-胺基酸產生藍紫色的 Ruhemann's purple，因此適合用於胺基酸分析，也是薄層層析分離胺基酸後的典型染色試劑。Proline 等具有次級胺基的胺基酸通常呈黃色，不能把所有胺基酸都視為相同顏色。 Ninhydrin 的功能主要是顯示胺基酸所在的位置與反應訊號，本身不負責將不同胺基酸分開。它也不是只與單一胺基酸反應的專一性試劑；若混合物尚未分離，不能僅靠總呈色訊號判定某一種胺基酸的含量。 在適當分離、校正與反應條件下，ninhydrin 呈色可以作為定量分析的偵測步驟。因此，「呈色法不能定量」過於絕對；正確觀念是單獨的一般呈色反應，通常不是特定胺基酸精確定量的最佳選擇。 試劑判斷重點 Ninhydrin胺基酸的典型呈色試劑，適合薄層層析後顯色。 Biuret主要利用肽鍵的反應測定蛋白質，不適合測定游離胺基酸。 Picrate、phosphotungstate不是胺基酸薄層層析後的最佳顯色選擇。 二、薄層層析：由極性判斷移動快慢 薄層層析（TLC）利用各成分與固定相、移動相作用程度不同而分離。當固定相具有極性、移動相為非極性溶劑時，與極性固定相作用較強的成分受到較多保留；較不具極性的成分則較容易隨移動相前進。 胺基酸側鏈特性在指定條件下的判斷 Isoleucine，異白胺酸非極性、疏水性側鏈相較於下列三者，移動最快。 Aspartic acid，天門冬胺酸酸性側鏈，具有額外羧基與極性固定相作用較強。 Arginine，精胺酸鹼性側鏈，具有胍基極性強，較易受到保留。 Serine，絲胺酸含羥基的極性側鏈可與極性固定相產生較強作用。 判斷時應先確認固定相與移動相的性質，再比較胺基酸側鏈。不能把「非極性跑得快」套用到所有層析系統；實際移動也會受溶劑組成與酸鹼條件影響，無須僅依側鏈性質硬排其餘三者的完整順序。 三、胺基酸定量方法的選擇 體液含有多種胺基酸及其他干擾物，因此精確定量需要足夠的分離能力、偵測選擇性及標準品校正。TLC 可觀察斑點並與標準品比較，但一般操作較適合定性或初步判讀，不易作為體液胺基酸精密定量的方法。 方法原理與適用重點 高效能液相層析（HPLC）先將胺基酸分離，再配合適當偵測方式定量；常藉衍生化提高偵測能力。與一般呈色、TLC、Guthrie 法相比，適合精確定量。 毛細管電泳（CE）利用分析物在電場中的電泳遷移率差異分離，具高分離效率，可建立體液胺基酸定量方法。與 Biuret、TLC、Guthrie 法相比，是適當的精確定量選擇。 質譜分析（MS）依質荷比及相關離子訊號分析，搭配分離、標準品與內標可作定量；適合特定胺基酸的分析。 氣體層析（GC）胺基酸本身不易揮發，通常須先衍生化成具有適當揮發性與熱穩定性的產物，才能進行分析與定量。 薄層層析（TLC）主要用於分離、定性及初步比較；一般不適合體液胺基酸的精密定量。 Guthrie 微生物試驗經典用途為苯丙酮尿症篩檢，依細菌生長反應估計苯丙胺酸含量，屬篩檢或半定量工具。 Guthrie 法的關鍵是解除抑制：培養基中的抑制物會抑制細菌生長，檢體內的苯丙胺酸可對抗此抑制作用，使細菌恢復生長，再依生長範圍估計含量。不可誤寫成「苯丙胺酸越多，越抑制細菌生長」，也不應描述為觀察抑制圈。 MS、HPLC 與 CE 的適用性須依分析方法與選項判斷。看到「精確」不能一律只選同一種儀器；若比較對象是 TLC、一般呈色或微生物篩檢，具良好分離與定量能力的儀器分析通常較適合。 四、檢體採集與去蛋白質前處理 檢測先天胺基酸代謝異常時，血液與尿液同時收集有助於比較血中濃度、尿中排泄及相關代謝異常。使用符合分析方法要求的肝素（heparin）抗凝採血管可取得血漿，也是可接受的採檢方式。 不可為了檢查而任意要求禁食或延長禁食。禁食會改變代謝狀態，對部分先天代謝異常患者也可能誘發失代償。在本單元的先天代謝異常採檢比較中，禁食是較不適宜的選項；但這不表示所有胺基酸檢驗都禁止空腹，實際飲食條件仍應依臨床需求與檢驗室規定。 體液游離胺基酸分析常須去蛋白質，以去除大分子蛋白質、降低分析干擾並協助終止酵素作用。這與蛋白質水解不同：前者去除蛋白質，後者切斷肽鍵並釋出胺基酸，會改變原本要測量的游離胺基酸組成。 採血後應儘速依規定分離血漿，避免溶血與血球持續代謝；不能立即分析時，依檢驗室要求保存或冷凍。延遲處理可能使不同胺基酸濃度升高或降低，不宜概括為全部都會升高。 常考陷阱 把顯色當成分離：ninhydrin 負責呈色，TLC 負責分離；兩者功能不同。 用 Biuret 測游離胺基酸：Biuret 的判斷關鍵是肽鍵，不能取代 ninhydrin。 忽略層析條件：極性固定相搭配非極性移動相時，isoleucine 相較於天門冬胺酸、精胺酸與絲胺酸移動最快。 把 TLC 當成精密定量首選：能看見斑點不等於能精確定量；體液分析應優先考慮適當的儀器方法。 認為 GC 完全不能測胺基酸：通常經衍生化後可分析，不能因胺基酸不易揮發便直接排除。 把 Guthrie 法原理寫反：苯丙胺酸解除生長抑制，觀察的是細菌生長反應。 把禁食視為一律必要：先天代謝異常採檢須依病況安排，不能自行要求禁食。 混淆去蛋白質與蛋白質水解：測體液游離胺基酸時，應避免以水解蛋白質改變待測組成。 記憶口訣 「薄層分開，茚三酮顯色；極性固定，疏水先行。」 「精量看液相、電泳、質譜；Guthrie 解抑制，篩檢看生長。」 「血尿同收、肝素可用、去除蛋白；禁食依規，不可任意。」