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學習重點 掌握反應環境與標的：Biuret 是鹼性銅離子與胜肽鍵反應；Bradford 使用 Coomassie blue，在酸性環境中與蛋白質結合；BCG 在酸性環境中主要與白蛋白結合。 分清 Lowry 與紫外光吸收：Lowry 使用鹼性銅處理及 Folin-Ciocalteu 顯色；280 nm 吸收則直接利用芳香族胺基酸的特性。 凱氏法以氮量推算蛋白質：酸消化產生銨離子，再測定氮量；一般換算為蛋白質含量時，須將含氮量乘以 6.25。 辨認靈敏度與適用範圍：在 Lowry、280 nm 吸收、折射法及一般濁度法的比較中，以 Lowry 靈敏度最佳；Sanger 與 Trinder 不屬一般蛋白質定量方法。 核心觀念 一、Biuret 雙縮脲法：測定銅與胜肽鍵形成的複合物 Biuret 法在鹼性環境下，使銅離子（Cu2+）與蛋白質的胜肽鍵形成紫色複合物，再由吸光度求得濃度。因此，測定依據是「胜肽鍵與鹼性銅離子形成複合物」，不是胜肽鍵本身的直接吸光，也不是芳香族側鏈的吸收。 一般至少具有兩個胜肽鍵的三胜肽以上，才能呈現典型反應；游離胺基酸不能產生典型 Biuret 反應。此法適合血清等蛋白質濃度較高的樣本，是常用的總蛋白質定量法，但靈敏度較 Lowry 低。 二、Bradford 法：Coomassie blue 在酸性環境中染色 Bradford 法使用 Coomassie Brilliant Blue G-250。染料在酸性環境中與蛋白質結合後，穩定呈藍色的形式，通常於595 nm測量吸光度。 染料結合尤其受精胺酸殘基影響，也涉及其他鹼性殘基及疏水性作用。因此，不宜將此法簡化為「只與芳香族側鏈結合」。不同蛋白質的胺基酸組成不同，顯色程度也可能不同，定量時須注意標準品的選擇。 此法的判斷關鍵是酸性、Coomassie、藍色顯色；不需要銅離子，也不使用 Folin-Ciocalteu 試劑，更不是以 280 nm 的吸收作為測定原理。 三、BCG 法：酸性染料結合測定白蛋白 bromocresol green（BCG，溴甲酚綠）在酸性環境中主要與白蛋白結合，產生顏色變化，再以吸光度定量，常用於血清白蛋白測定。 BCG 與 Bradford 都屬染料結合法，但使用的染料與測定目的不同。BCG 主要測白蛋白，不能直接視為總蛋白質測定法；其他蛋白質的非專一性結合，可能影響白蛋白測定結果。 四、Lowry 法：鹼性銅反應加上 Folin 顯色 Lowry 法先使蛋白質與鹼性銅試劑反應，再利用 Folin-Ciocalteu 試劑產生顯色。其訊號與銅反應及蛋白質中的酪胺酸、色胺酸等殘基有關。 Lowry 法靈敏度較高。比較 Lowry、280 nm 吸收、折射法及一般濁度法時，應掌握Lowry 最靈敏；但不宜將這個結論擴大為所有蛋白質測定技術的絕對排名。 依本單元的判讀原則，完全不含色胺酸與酪胺酸的蛋白質，不適合使用 Lowry 法定量。凱氏法以氮量為依據，Biuret 以胜肽鍵為依據，一般染料結合法也不以這兩種殘基為共同必要條件。 五、凱氏定氮法：由氮含量換算蛋白質 Kjeldahl 法利用蛋白質含氮的性質。以濃硫酸加熱消化樣本，使有機氮轉成銨離子；後續將消化液鹼化，釋出氨，再經蒸餾收集及測定，求得氮量。須分清：酸用於消化，鹼用於釋放氨，不能說成利用鹼性分解蛋白質。 一般以蛋白質平均約含 16% 氮作為換算基礎，故換算係數為 100 ÷ 16＝6.25： 蛋白質含量＝蛋白質氮量 × 6.25。 例如蛋白質氮為 1 g，換算蛋白質為 6.25 g。計算時是乘以 6.25，不是除以 6.25；16 是平均含氮百分比的數值，不是直接使用的乘數。 凱氏法不具有蛋白質專一性。尿素等非蛋白質含氮物也會被計入，若未適當分離或扣除，直接將總氮換算成蛋白質，可能使結果偏高。因此，不能認為血中尿素不會干擾。 六、其他方法與易混淆檢驗 方法原理與用途判斷關鍵 280 nm 吸收利用芳香族胺基酸的紫外光吸收，主要來自色胺酸與酪胺酸。芳香環直接吸光；結果受蛋白質組成影響。 折射法由溶液折射率估算蛋白質濃度，可用於血清或血漿。其他溶質也會影響折射率，專一性有限。 濁度法使蛋白質沉澱或聚集，測量產生的濁度。與粒子散射光有關，受沉澱條件及粒徑影響。 Sanger 法標記並鑑定胜肽的 N 端胺基酸。用於蛋白質結構分析，不是常規體液總蛋白質定量法。 Trinder 反應常以過氧化氫參與的酵素顯色反應測定特定分析物。不是一般蛋白質定量法。 Guthrie 測試利用細菌生長抑制原理進行苯酮尿症篩檢。不是利用蛋白質芳香環吸光。 Jaffe 反應肌酸酐與鹼性苦味酸反應顯色。測定肌酸酐，不是蛋白質定量。 常考陷阱 「Biuret 在酸性下反應」：錯。必須抓住鹼性銅離子與胜肽鍵形成複合物。 「Bradford 使用 Folin；Lowry 使用 Coomassie」：兩者對調。Bradford 配 Coomassie，Lowry 配 Folin-Ciocalteu。 「Coomassie 需要銅離子，或測量 280 nm」：錯。其核心是酸性染料結合，通常測量 595 nm。 「BCG 測定總蛋白質」：不恰當。BCG 主要測白蛋白；常規總蛋白質測定應聯想到 Biuret。 「完全不含色胺酸及酪胺酸，仍可正常用 Lowry 定量」：不符合本單元判讀。須留意 Lowry 顯色對這些殘基的依賴。 「凱氏法測胜肽鍵、咪唑基或酪胺酸」：錯。直接測定的依據是氮量，並由此換算蛋白質。 「含氮量除以 6.25」「尿素不干擾」：皆錯。應乘以 6.25，且須注意非蛋白質氮。 「所有顯色檢驗都能測蛋白質」：錯。先確認反應標的，Sanger、Trinder、Guthrie 與 Jaffe 各有不同用途。 記憶口訣 「雙縮鹼銅配胜肽，Bradford 酸中染藍色；BCG 酸中測白蛋白，Lowry 配 Folin。」 「芳香吸光二八零；凱氏酸消化、鹼放氨，量氮乘上六點二五。」