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學習重點 分清量測的光：吸收法測外來光的減弱，散射法測顆粒散射的光，發射法測待測物受激後釋放的光。 掌握螢光三要點：需要激發光、激發波長通常短於發射波長、典型儀器分別選擇激發與發射波長。 區分螢光與化學冷光：兩者皆有發射光；前者由光激發，後者由化學反應提供能量，不需外加激發光源。 辨識雷射介質：ArF 屬準分子雷射，紅寶石屬固態雷射，He-Cd 屬金屬蒸氣氣體雷射；汞弧燈不是雷射。 核心觀念 一、螢光的產生與波長關係 螢光分析是讓螢光物質吸收外來光能，進入激發態，再回到較低能態時放出光。外來光稱為激發光（excitation light），放出的光稱為發射光（emission light）。 由於部分能量先經非輻射途徑散失，發射光的能量通常較低。光子能量與波長成反比，因此激發光波長通常短於發射光波長，這種波長差稱為 Stokes shift。此關係也適用於螢光顯微鏡的基本判斷。 二、螢光儀的構造、靈敏度與應用 典型螢光光譜儀的光路為：光源→激發光單色器→樣品→發射光單色器→偵測器。前者選出照射樣品的波長，後者選出待測螢光波長，降低激發光及其他雜光的干擾。因此，判斷需要兩個單色器的典型儀器時，應選螢光儀。實際部分螢光儀可使用濾光片選波，重點仍是分別選擇激發與發射光。 一般溶液螢光儀的偵測方向與入射激發光呈約直角，以減少激發光直接進入偵測器。因此「光源和偵測器在同一直線上」不是一般螢光儀的正確描述。 螢光顯微鏡利用激發濾光片、二向色鏡及發射濾光片分離兩種光，不能將溶液螢光儀的直角配置直接套用到所有顯微鏡光路。常見激發光源包括汞弧燈、氙燈、LED 或雷射；鹵素燈不是傳統螢光顯微鏡的代表光源。 螢光法通常比一般吸光法敏感，可用於藥物濃度測定、螢光免疫分析及自動化免疫分析。流式細胞分析儀也利用螢光訊號辨識細胞及其標記，並可同時量測散射光。 在適當的低濃度範圍及固定條件下，螢光強度可近似與濃度成正比；不能直接把螢光訊號當成 Beer’s law 的吸光度。血清仍可能有自發螢光、散射、吸收及螢光猝滅等干擾，不能因靈敏度高就推論背景干擾物少。 三、吸收、散射與發射光學分析比較 方法量測訊號判斷關鍵 原子吸收光譜法待測原子吸收特徵光造成的衰減需外加特徵光源，常用空心陰極燈；測吸收。 火焰光度法待測元素在火焰中受激後發出的特徵光火焰提供激發能量；測待測物的發射光。 濁度法（turbidimetry）懸浮顆粒造成的透射光減少需光源；偵測器沿透射光方向接收光。 散射比濁法（nephelometry）懸浮顆粒散射的入射光需光源；在偏離入射光的角度量測，常見為側向偵測。 螢光法物質吸收激發光後放出的螢光需激發光源；通常發射波長較長。 化學冷光法化學反應形成激發態後放出的光不需外加激發光源，但仍需光偵測器。 散射光不是待測物受激後新產生的螢光。散射比濁與螢光儀雖可能都採側向接收，量測原理仍不同。滲透壓儀則依溶液依數性，例如凝固點下降進行測定，不是以雙單色器分析螢光的儀器。 四、化學冷光的原理與反應物 化學冷光又稱化學發光（chemiluminescence），由化學反應產生激發態產物或中間體，回到較低能態時釋放光子。能量來自化學反應，因此測量儀器不需配置外加激發光源，但仍須有偵測器將光轉成電訊號。 Luminol（魯米諾）是典型化學冷光試劑，可在適當氧化反應條件下發光。過氧化氫、氧氣等可參與不同發光反應；luciferin（螢光素）則是生物發光系統的受質。這些物質可用於相應的發光分析，並非所有系統都必須同時加入。 生物發光可視為化學發光的一類。例如螢火蟲 luciferin 與 luciferase 系統需要 ATP，但不是所有生物發光或化學冷光都需要 ATP。螢光本身也不以消耗 ATP 為共同必要條件。 Fluorescein、propidium iodide 與 rhodamine 是常見螢光染劑；判斷典型化學冷光試劑時，應辨識 luminol，不能只因物質會發光就視為同一類。 五、免疫分析的光源需求 分析方式光源需求與原因 螢光免疫分析需激發光源，才能使螢光標記放出光。 螢光偏極免疫分析需偏極激發光，再分析發射螢光的偏極程度。 一般比色酵素免疫分析需光源，以吸光度量測酵素反應形成的有色產物。 酵素增幅免疫分析（EMIT）常以吸光度變化追蹤酵素活性，需量測光源。 化學冷光免疫分析由發光反應直接產生訊號，不需外加激發光源。 酵素是催化反應的標記，其光源需求仍取決於最後量測吸光、螢光或化學冷光；不能單憑「使用酵素」就推論不需光源。 六、雷射種類與增益介質 雷射以增益介質中的受激輻射放大光，通常具有良好方向性及較窄的光譜範圍。高亮度燈源不一定是雷射，應依發光機制與介質判斷。 名稱分類辨識重點 Argon fluoride（ArF）準分子雷射以氬與氟形成的激發態物種作為增益介質。 Ruby，紅寶石雷射固態雷射增益介質為摻鉻的氧化鋁晶體，記作 Cr:Al₂O₃。 Helium-cadmium（He-Cd）金屬蒸氣氣體雷射利用鎘蒸氣中的離子躍遷發光；金屬蒸氣雷射屬氣體雷射的一類。 Mercury arc lamp，汞弧燈非雷射光源以汞蒸氣放電產生弧光，可作螢光激發光源，但不是雷射。 常考陷阱 「螢光激發波長較長」：通常是激發波長短、發射波長長。 「螢光儀光源與偵測器同一直線」：一般溶液螢光儀常採直角接收，以降低激發光干擾。 「螢光較敏感，所以血清背景干擾少」：靈敏度與檢體背景是不同概念，血清可有自發螢光等干擾。 「螢光與化學冷光皆需激發光或 ATP」：兩者共同點是都有發射光，能量來源不同。 「不需光源就不需偵測器」：化學冷光仍須偵測反應放出的光。 「火焰光度法測吸收，散射比濁測自行發光」：火焰光度法測發射光；散射比濁測外來光被顆粒散射的訊號。 「He-Cd 與金屬蒸氣雷射無關，汞弧燈是雷射」：He-Cd 屬金屬蒸氣氣體雷射；汞弧燈是放電燈源。 記憶口訣 「螢光先照、冷光反應；激發短波、發射長波；雙選波、側收光；火焰看發射、濁度看透射、散濁看散射。ArF 準分子、紅寶石固態、氦鎘金屬蒸氣、汞弧不是雷射。」